利巴韋林和金剛烷胺屬于抗病毒藥物，在防治人類流感類疾病方面應(yīng)用廣泛，但濫用這兩種藥物也會(huì)造成一系列負(fù)面效果。部分養(yǎng)殖戶將其非法用于畜禽疫病防治，藥物通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，長(zhǎng)期累積后會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，并直接誘導(dǎo)人類流感病毒產(chǎn)生變異及耐藥性增強(qiáng)，從而威脅人類健康。

 

       美國(guó) FDA 和我國(guó)農(nóng)業(yè)部都已明確禁止將這兩種藥物作為獸藥使用。然而，非法使用這兩種藥物的現(xiàn)象還時(shí)有發(fā)生。安捷倫開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)分析利巴韋林和金剛烷胺的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方案，配合監(jiān)管部門(mén)打擊藥物濫用的情況。

 

       利巴韋林和金剛烷胺分析

 

       對(duì)樣品進(jìn)行前處理。稱取樣品 2 ± 0.01 g，置于 50 mL 離心管中，加入 40 μL 混合內(nèi)標(biāo)溶液（ D15-金剛烷胺：200 μg/L，13C5-利巴韋林：1000 μg/L），再加入 5 mL 0.5 mmol/L 乙酸銨溶液 (pH 4.8) 和 40 μL 0.25 U/μL 酸性磷酸酶溶液（購(gòu)于 Sigma 公司），渦旋 30 秒，置于搖床上，37 °C 恒溫避光酶解 2 小時(shí)。

 

       在酶解液中加入 4 mL 5% 三氯乙酸溶液，渦旋 30 秒，10000 r/min低溫離心 10 分鐘，移取上清液于另一離心管中，用 5% 氨水調(diào) pH 至 8.5 ± 0.1，加水定容至 10 mL，再次離心，得到上層澄清提取液。

 

       取 5 mL 樣品提取液經(jīng) Agilent Bond Elut PBA/PCX 復(fù)合固相萃取柱富集和凈化后，使用配備 Agilent Poroshell 120 SB-Aq 色譜柱的 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)/6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析。

 

       凈化保留原理

 

       方法中所采用的 Bond Elut PBA/PCX 固相萃取柱可同時(shí)有效地保留和凈化樣品中的利巴韋林和金剛烷胺。PBA 可以同時(shí)保留酶解后游離出的核苷酸和利巴韋林，而在酸性洗脫條件下，利巴韋林被洗脫下來(lái)，而核苷酸在被洗脫后重新以陽(yáng)離子交換機(jī)理保留 PCX 填料層；金剛烷胺在開(kāi)始時(shí)以反相機(jī)理被保留在 PBA 或者 PCX 填料上，在酸性條件下洗脫利巴韋林時(shí)則在 PCX 填料層轉(zhuǎn)換為陽(yáng)離子交換機(jī)理進(jìn)行保留，從而能夠使用甲醇淋洗去除更多非極性保留雜質(zhì)。整個(gè)前處理方法不但保證了更加干凈的凈化效果，同時(shí)也大大縮短了樣品前處理時(shí)間。

 

       檢測(cè)時(shí)，配合 Poroshell 120 SB-Aq 色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析，Poroshell 120 SB-Aq 色譜柱采用薄殼型極性修飾反相固定相 SB-Aq，可以耐 100% 的純水相，使色譜柱在低 pH 條件下使用時(shí)也有較長(zhǎng)的壽命，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的快速分離分析。

 

       本方法適合于雞肉和雞蛋中利巴韋林和金剛烷胺殘留的檢測(cè)。方法中利巴韋林和金剛烷胺的定量限分別為 0.08 ng/g 和 0.03 ng/g，分別在 0.1–1000 ng/mL 和 0.02–50 ng/mL 范圍內(nèi)線性相關(guān)良好。利巴韋林和金剛烷胺分別在 1.5–15 ng/mL 和 0.3–3 ng/mL 加標(biāo)濃度下，在不同基質(zhì)中的平均回收率分別為 94.26%–108.50% 和 86.66%–111.90%，RSD 均小于等于 3.75 (n = 3)。